Analytické metody - chromatografie I.

Samotný název pochází ze dvou slov: chromos - barva a graphein - psaní. Její pojmenování bylo celkem nasnadě, protože Cvět tuto techniku poprvé použil při rozdělování rostlinných barviv na kolonách naplněnými tuhým adsorbentem. Od 30. let 20. století dále docházelo k rozvoji techniky. Tomu přispěly práce o adsorpčních a desorpčních jevech, které hrají jednu z významných rolí v chromatografii. Dalším významným mezníkem v historii chromatografie přinesly práce A. J. P. Martina a R. L. M. Synge, kteří položili základy papírové chromatografii a za svoje objevy získali v roce 1952 Nobelovu cenu za chemii. Další rozvoj techniky způsobil, že se chromatografie stala třetí nejpoužívanější technikou v analytické chemii pouze za vážením a měřením pH [1].

Dle IUPAC (Mezinárodní unie pro čistou a užitou chemii) má chromatografie následující definici: "Chromatografie je fyzikální separační metoda, při níž jsou separované složky distribuovány mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je stacionární a druhá se pohybuje v daném směru." [1] Stacionární fází se v tomto případě rozumí látka, která má schopnost zadržovat různou měrou jednotlivé složky analyzované látky. Druhá fáze, pohyblivá neboli mobilní, unáší analyzovanou látku kolonou. Jedná se buď o plyn nebo o kapalinu a podle toho se chromatografie dělí na plynnou nebo kapalinovou. Dle některých definic chromatografie se jedná o transport částic analyzované látky mezi stacionární a mobilní fází a k mnohonásobnému ustavování rovnováhy. To lze vysvětlit následovně. Na mezifázovém rozhraní mezi mobilní a stacionární fází dochází k přenosu molekul analyzované látky. Každý přenos je charakterizován nějakým rovnovážným stavem. Zjednodušeně lze říci, že se jedná o stav, kdy se uvolní určité množství látky ze stacionární fáze do mobilní a současně se stejné množství látky přenese z mobilní fáze do fáze stacionární.

Z historického hlediska lze rozlišit i další typy chromatografie, a to podle toho, jaké fyzikálně-chemické síly rozhodují o transportu mezi mobilní a stacionární fází (tj. o separačním mechanismu). Princip dělení proto může být založen na sítovém efektu, adsorpčně-desorpčních jevech, rozpustnosti analyzované látky nebo iontově výměnném mechanismu. Většinou však dochází k situaci, kdy o rozdělení složek analyzované látky rozhoduje více jevů než jeden. Aby však mohla být využita chromatografie k dělení směsi látek, musí se významně lišit v některé fyzikálně-chemické vlastnosti. Např. při využití sítového efektu se jedná o velikost molekuly, v případě rozpustnosti se musí jednotlivé plynné složky rozpouštět různou měrou ve stacionární fázi apod. V případě, že se látky liší některou svou vlastností, dojde k rozdělení směsi látek, jinými slovy každá látka se v koloně zdrží různě dlouhou dobu. Tato doba má pak název eluční čas, případně pokud můžeme analyzovat objem mobilní fáze, eluční objem. Plynové a kapalinové chromatografy pak obsahují detektory, které jsou schopny určit i množství dané látky, která se do detektoru dostala. Chromatografie tedy podává informace kvalitativní (tj. jaká je to látka) i kvantitativní (kolik látky je ve směsi).

Jak bylo řečeno v úvodu, chromatografických metod můžeme nalézt několik. V tomto článku se zaměříme na sloupcovou a gelovou chromatografii, ostatním chromatografickým metodám budeme věnovat samostatný článek. Sloupcová chromatografie stála na počátku rozvoje techniky. Právě s využitím sloupce adsorbentu rozdělil Cvět rostlinná barviva. Tato technika je levná a k jejímu provedení postačí základní laboratorní vybavení. Nutnou podmínkou u sloupcové chromatografie je nereaktivnost adsorbentu s mobilní fází nebo s dělenými složkami. Dále se adsorbent nesmí v mobilní fázi rozpouštět. A nakonec, adsorbent musí mít velkou adsorpční kapacitu s rychlým ustavením rovnovážných stavů. Dělení sloupcovou chromatografií je založeno na rozdílných distribučních konstantách jednotlivých složek směsi. To znamená, že mezi mobilní a stacionární fází jsou rozdílné koncentrace složek směsi. Samotné provedení sloupcové chromatografie už je poměrně jednoduché. Po naplnění kolony adsorbentem se do kolony začne nalévat mobilní fáze - často to jsou směsi organických rozpouštědel. Po naplnění kolony mobilní fází se na start kolony přivede směs látek, kterou chceme rozdělit. Během procesu dělení je nutno přivádět na start kolony (tj. její vrchní část) mobilní fázi pokud možno s konstantním průtokem. Pod kolonou pak lze odebírat jednotlivé složky z rozdělované směsi. Jistou nevýhodou této rozdělovací techniky je to, že mobilní fáze značně zředí získanou látku. Používanými adsorbenty v kolonách bývá často silikagel, alumina, křemičitan hořečnatý nebo třeba aktivní uhlí.

Gelová chromatografie je jednoduchá metoda jejíž princip separace je založen na sítovém efektu a složky směsi jsou tak děleny na základě velikosti a tvaru molekuly. Jako náplň kolony se používají porézní látky, u nichž jsou póry naplněny mobilní fází. Při využití tohoto druhu chromatografie dochází nejprve k získání frakce molekul s největší velikostí, nakonec se získávají nejmenší molekuly. Proč tomu tak je? Protože malé molekuly jsou schopné pronikat do pórů náplně, kdežto velké molekuly se do pórů jednoduše nevejdou. Proto jsou unášeny mobilní fází okolo jednotlivých částic náplně kolony a dráha, kterou musí tyto velké molekuly urazit je nejkratší. Malé molekuly, které jsou schopny proniknout do pórů gelu jsou pak pomalu vymývány mobilní fází, ale dráha kterou během pronikání náplní urazí je mnohem větší a tím pádem dojde k nejdelšímu zadržení v koloně. Gelovou chromatografii lze využít například oddělení vysokomolekulárních látek jako jsou bílkoviny nebo nukleové kyseliny od zbytku směsi. Tomuto procesu se říká odsolování. Dále se tato technika široce využívá k rozdělení polymerních látek - například u různého stupně polymerace.

Cílem tohoto článku bylo stručné vysvětlení principu chromatografie a ukázka toho, že se jedná o jednu z nejvíce využívaných analytických technik v současném světě chemie. V příštím článku bude vysvětlen princip dvou nejvíce využívaných technik chromatografie, a to plynové a kapalinové.

Použité zdroje:

[1] Švec, F.,Chemické listy 103 (2009) 266 - 270
Mikeš, O. a kolektiv,Laboratorní chromatografické metody, SNTL, Praha 1980, 674 s.

Autor: Martin Kout, MKout@seznam.cz