Analytické metody - spektroskopie v UV-Vis oblasti

Pod pojmem spektroskopie si můžeme představit obor, který studuje interakce mezi zářením a studovanou látkou. Laicky řečeno zkoumáme co nastane, pokud svítíme světlem na vzorek. Elektromagnetické záření obsahuje dvě složky elektrickou a magnetickou. Tyto složky kmitají ve vlnách, která mají průběh sinusoidy, přičemž obě složky kmitají v rovinách, které jsou k sobě orientovány kolmo. Obecně lze záření rozdělit na několik oblastí podle toho jakou má energii anebo naopak podle veličiny zvané vlnová délka. Čím kratší je vlnová délka záření, tím má záření větší energii. Záření lze tedy rozdělit na oblasti se snižující se energií následovně: gamma záření, roentgenové (označované jako paprsky X), ultrafialové, viditelné, infračervené, mikrovlnné a radiové záření.

Spektroskopické metody, respektive přístroje k tomu určené, umožňují sledovat některé veličiny. Tyto veličiny si teď ve stručnosti popíšeme. Patří mezi ně transmitance, absorbance, reflektance a luminiscence. Transmitance je veličina, která udává kolik procent světla ze zdroje projde vzorkem na detektor. Dalo by se říci, že se jedná o průchodnost vzorku. Z matematického hlediska se tedy jedná o poměr intenzity toku světla, které projde na detektor, a intenzity toku světla ze zdroje. Transmitance nabývá hodnot mezi 0 a 1, respektive 0 - 100 %. Druhou veličinou je absorbance, která udává míru absorpce světla zkoumaným vzorkem. Absorbanci lze vyjádřit i z transmitance, a to podle vztahu A = -log T. Absorbanci je možno ale vyjádřit i na základě Lambert-Beerova zákona. Ten říká, že absorbance vzorku je přímo úměrná koncentraci stanovované látky, tloušťce vzorku a charakteristické konstantě, která se nazývá absorpční nebo extinkční koeficient. Absorbance nabývá hodnot od nuly (vzorek neabsorbuje) až do nekonečna (vzorek absorbuje veškeré světlo). Další z veličin, kterou je možno měřit je reflektance. Tato veličina je měřena zejména u pevných vzorků, kdy světlo ze zdroje je mnohonásobně rozptýleno vzorkem. Světlo je rozptylováno všemi směry, a proto jsou některé spektrometry určené pro měření reflektance vybaveny zařízením, které se jmenuje integrační koule. Je to komora kulovitého tvaru, která je uvnitř potažena materiálem, který by měl veškeré dopadající záření odrazit. A po mnohonásobném odrazu jej směrovat na detektor. Poslední z veličin, kterou je možno měřit je luminiscence. Luminiscence je jev, kdy vzorek absorbuje určitou část zdrojového záření, tím dojde ke zvýšení energie vzorku, kterou vyzáří ve formě záření o jiné energii (jiné vlnové délce). A toto světlo je práce registrováno při luminiscenčním typu měření. Často může být detektor určující míru luminiscence umístěný v kolmém směru na zdrojové záření, aby nedocházelo k mylnému určení zpětně vyzářeného světla ze vzorku.

Moderní spektrofotometry jsou vybaveny několika základními částmi. Mezi ně se řadí zdroj záření. Jako zdroje záření jsou používány deuteriové výbojky pro ultrafialovou oblast a pro viditelnou oblast wolframová žárovka nebo halogenová výbojka. Zdroje záření však poskytují světlo v určitém intervalu vlnových délek, nikdy ze zdroje nevychází záření o jedné dané vlnové délce. Pro správnou funkci přístroje a určení charakteristických skupin vzorku je nutno zařadit mezi zdroj světla a vzorek tzv. monochromátor. Jeho funkcí je oddělení záření ve velmi úzkém intervalu vlnových délek. Další nezbytnou součástí jsou detektory. Pro detekci se používá tzv. fotodiod. Využití fotodiody umožňuje detekovat záření o pouze jedné vlnové délce. Proto se začínají používat CCD prvky, které obsahuje velké množství fotodiod a tento typ detektoru umožňuje snímání spektra v širokém intervalu vlnových délek.

Spektrofotometry se mohou konstruovat ve dvojím typu uspořádání, tzv. jednopaprskovém a dvoupaprskovém. Jednopaprskový spektrofotometr je starším, ale jednodušším typem. Vzhledem k faktu, že ve spektroskopické metodě je nutno nejprve změřit spektrum standardu před měřením samotného vzorku, je nutno standard a vzorek měřit postupně v čase. U dvoupaprskového spektroskopu dochází k rozdělení zdrojového záření do dvou měrných prostorů a tudíž je možno porovnávat standard s měřeným vzorkem ihned.

Co je možno měřit touto metodou? Dalo by se říci, že se jedná o univerzální metodu, která umožňuje sledování nejrůznějších vzorků a získání sady dat pro určení mnoha veličin. První možností je určení tzv. barevné křivky. Jedná se o typ měření, kdy po proměření standardu se měří absorbance vzorku s měnící se hodnotou vlnové délky dopadajícího záření. Tento typ měření se používá u kapalných vzorků. Často se jedná o vodné roztoky látek, proto se jako standard používá voda. Každý vzorek absorbuje při určité vlnové délce více než při jiných. Vzniká tak spektrum, které obsahuje píky neboli pásy. Z polohy pásu, tj. hodnoty vlnové délky lze určit některé charakteristické skupiny zejména u organických látek. Znalosti maxima absorpce při dané vlnové délce se využívá u dalšího typu měření - stanovení koncentrace látky ve vzorku. Často se jedná o situaci, kdy víme jakou látku vzorek obsahuje, ale je nutno určit její koncentraci. Postup pro určení je poměrně jednoduchý. Nejprve je nutno připravit si sadu kalibračních roztoků o různé koncentraci látky, kterou stanovujeme. Víme-li při jaké vlnové délce roztok nejvíce absorbuje, nastavíme na spektrofotometru použití záření o této vlnové délce a určíme hodnotu absorbance. Z kalibračních roztoků tak získáme sadu dat, které slouží k tvorbě kalibrační závislosti (do grafu se vynáší závislost absorbance na koncentraci). Lambert-Beerův zákon je lineární závislostí (neplatí při vysokých koncentracích látek ve vzorcích), jedná se tedy o kalibrační přímku. A následně je zjištěna hodnota absorbance stanovovaného vzorku. Z kalibrační závislosti se následně dopočítá koncentrace látky v neznámém vzorku. Další z možných měření je určování koncentrace látky v závislosti na čase. Tento způsob se využívá při zjišťování kinetických dat, např. určení rychlostní konstanty dané reakce. Postup měření je opět celkem jednoduchý. Do kyvety se vpraví všechny reakční složky, které se  reakce účastní. Nutnou podmínkou pro zjištění kinetických dat je, aby jedna z reakčních komponent měla maximum absorpce v jiné oblasti než ostatní reakční složky. Je jedno, jestli se jedná o výchozí látku nebo o produkt. Samotné měření pak spočívá v měření absorbance při jedné dané vlnové délce v závislosti na čase. Pokud sledujeme koncentraci výchozí látky, bude klesat hodnota absorbance, sledujeme-li koncentraci produktu, bude absorbance růst. Posledním typem měření, o kterém se zmíníme, se vztahuje k využití spektroskopie pro pevné vzorky. V tomto případě se spektrofotometrem sleduje závislost reflektance na vlnové délce použitého záření. Získá se tak obdoba barevné křivky kapalných vzorků. Ve spektru se opět objevují oblasti s vyšší mírou rozptylu. Vyhodnocení pak často probíhá přepočtem změřené reflektance na hodnotu Kubelka-Munk funkce. Pro rámec tohoto textu není podstatné dle jakého vztahu se přepočet provádí. Ze získaného spektra je pak možno určovat např. přítomnost částic v heterogenních katalyzátorech. Jako příklad lze uvést katalyzátory na bázi niklu, které se v současné době zkoumají hlavně díky jejich poměrně nízké ceně. Ve spektru je možno určit charakteristické pásy příslušející NiO nebo jiným částicím dvojmocného niklu.

Předmětem tohoto článku bylo přiblížení analytické metody spektroskopie v UV-Vis oblasti. Z článku by mělo být patrné, že se jedná o techniku s širokou využitelností v nejrůznějších oblastech chemie přes potravinářství, farmacii ale i oblasti katalýzy či ochrany životního prostředí. Umožňuje zjištění koncentrací látek nebo informací vedoucích k zjištění kinetických parametrů reakcí.

Autor: Martin Kout, MKout@seznam.cz